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作者心情:其他 天气:晴天 评论 发表时间:2017-09-17 22:36:04
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1.关于Trizol的购买:

目前市面上买的大多是100ml装的,比较出名的是Invitrogen公司的Trizol,100ml原装的据说要1200大洋以上,不过有一种据说香港分装的,只需600元,但是相对国产品牌三四百元的价格还是贵了一些。国产很多公司都有类似的Trizol试剂,价格大多三百多元,成分都差不多,可以说都是invitrogen的山寨产品。比如我用的是北京一家公司的,四百多,做出来也还不错。Takara有一款专门提取small RNA的trizol,好像贵一些。

2.关于配套试剂:

Trizol法提取RNA是要用到氯仿、异丙醇和乙醇的。氯仿现在是违禁品,不大好买(我们学校试剂科现在不卖),所以买的时候要让试剂上给送,一般他们都能免费给送。氯仿遇光易分解,试剂商给你的时候应该是遮光的。异丙醇虽然没有特殊说明,但我查的据说也是最好避光保存,不过这种试剂都是棕色瓶子,能遮蔽大部分的光线了。 日记谷 http://www.gzkuaiji.net/

3.关于实验时的防护:

RNA很容易降解,所以实验时一般都要求口罩帽子的,避免组织的污染。不过以我的经验,好像内源性的RNA酶才是最主要的,也就是组织内本身的RNA酶。开始我是很小心,口罩手套帽子的,但是提取出来发现还是降解了,后来有经验了,即使组织掉在地上,拿回去继续提也没问题(前提是不能化冻)。所以最最重要的是组织在液氮研磨成粉末并加Trizol 之前不能化冻,这也是fast200法提取效果不好的原因(fast200法一般不用液氮研磨)。

4.关于液氮研磨:

万事开头难,液氮研磨是最开始的步骤,也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮,毕竟是零下近200度的东西,当然不是闹着玩的。不过只要小心操作,一般没啥问题,我提了一个多月的RNA,对液氮是很亲切了,呵呵。我是找了一个保温杯,倒出一些液氮,然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮,组织会慢慢变脆,就会好研一些,对于一些含水量比较大,很硬的组织,我是准备了刀片,切成小块后再研磨,一定研磨充分,不要求研磨成奶粉状,但至少得看不到明显的颗粒,这样Trizol才能充分和组织接触,快速裂解组织,也能防止组织的降解(Trizol内含RNA酶抑制剂)。 http://www.gzkuaiji.net/

5.关于组织量:

研磨前最后称一下组织的重量,毕竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的组织。Trizol里面是含有RNA酶抑制剂的,如果组织过量,Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织,多余组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。

6.关于提取步骤:

标准Trizol提取步骤为 液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。

因为提取的组织,在加入Trizol后增加了一步简短的离心,可以帮助去掉一些无法降解的组织,比如纤维和杂质之类,然后取上清再加入氯仿,可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后,可以将裂解液放到-80冻存半小时以上,据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞,分离蛋白和RNA。我试了一下,的确有效果。

7.关于个步骤的时间:

标准的时间是

a.液氮研磨(没时间要求,只要组织不化就好,我一般一个组织十分钟左右,女孩子可能时间长一些,毕竟体力活)

b.加入Trizol裂解5-10分钟(我觉得还是10分钟比较好,有人说这步要放在冰上,但是我的经验室温就可以,室温更有利于Trizol完全发挥作用,而且毕竟Trizol含有RNA酶抑制剂,不用担心RNA降解)

c.加入氯仿室温静置15分钟(国产试剂真是坑爹啊,说明书把这步时间缩短到3分钟,出来效果奇差)

d.离心15分钟,这是管见的一步,离心后分成三层,RNA在上清里,所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧,以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻,切忌吸取太多,少量即可,洗到400-500ul就OK了,再多就容易碰到下层沉淀了。

e.加入异丙醇静置10min,然后离心10min。

f.用75%酒精洗涤沉淀,帮助分离剩余的有机试剂(剩余右击试剂过多会影响OD值和PCR反应),所以酒精尽量多加一些,一般说明书没有说明这一步的时间,只是说剧烈涡旋震荡,我的经验是一定把沉淀弹起来,让浮在酒精中,然后放1-2min,让酒精充分接触沉淀,充分溶解有机试剂,然后再离心。

g.加入DEPC处理水,组织提取出来的量还是挺大的,虽然不是很纯,所以溶解液还是不能太少,至少要50ul,之前一个大姐给我说加20ul就可以,结果浓度直接高得光度计测不出来了。而且浓度太高跑电泳时也跑不开,没法鉴定。

8.关于RNA电泳鉴定:

RNA很脆弱,跑电泳的时候也容易降解,但是也没必要就非得用崭新配置的TBE电泳液,电泳液不要太脏就可以。电泳点样量不要太大,毕竟组织提取的RNA纯度不会很高,多少还有一些杂质,太多的话不仅容易使RNA降解,还有影响电泳效率,跑不开。



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